LNPs（Lipid Nanoparticles，脂質納米顆粒）因在COVID-19 mRNA疫苗中成功發揮作用，有效地保護和運輸mRNA到細胞而聞名。然而，我們需要徹底理解這些系統的生物物理特性，以確保它們的安全性、穩定性和有效性，并確保監管部門的批準。動態光散射(DLS)是一種公認的工具，可以通過提供粒徑和聚集形成的信息來幫助LNPs的生物物理表征。多角度動態光散射(MADLS)則更進了一步：傳統的單角度背向散射只能提供粒徑信息，而多角度檢測可以產生更高分辨率的粒徑分布(PSD)和顆粒濃度數據。

什么是脂質納米顆粒?

LNP通常呈球形，由脂質核心基質組成，脂質核心基質本身通常由可電離的離子脂質、聚乙二醇化脂質和膽固醇組成 (圖1)。這些都有助于在不同的生物環境中穩定和保護LNP——這一點很重要，因為作為藥物遞送載體，LNP可以運輸疏水或親水分子，包括小分子、蛋白質和核酸[2]。當然，我們了解它們物理特性的能力對于獲得監管機構的批準至關重要。

圖1 本研究表征的mRNA-LNP的基本結構和組成示意圖

LNP的兩個重要物理屬性是粒徑分布(PSD)和多分散性。DLS測量顆粒在單角度(通常為背散射或側散射角)進行布朗運動時散射強度的波動，通過使用累積量或非負最小二乘法(NNLS)分析波動，DLS數據提供了樣本內平均直徑(Z-average)、多分散性指數(PdI)或PSD的信息。觀察平均粒徑(Z-average)和多分散性指數(PdI)的變化是監測LNP制劑穩定性的常用方法。

MADLS是一種比單角度DLS更高級的選擇，它使用三個不同的檢測角度（前向、側向和背向）進行PSD測量，該測量考慮了角度相關的散射信息，因此可以在包含多種尺寸種群的樣品中獲得更高分辨率的粒度分布(PSD)圖像。此外，MADLS允許我們計算樣品中每個種群的總顆粒濃度[3]。

本研究使用了兩種mRNA-LNP配方: LNP1和LNP2。動態光散射(DLS)和多角度動態光散射(MADLS)的測量使用馬爾文帕納科Zetasizer Ultra納米粒度及電位分析儀，使用波長為632.8 nm的He-Ne氣體激光器，最大功率為10 mW。單角度DLS數據來自MADLS測量，因為它是測量的三個角度之一，并且您可以查看測量中的所有角度數據。單角度DLS數據 (NIBS，圖2，藍色) ，并與MADLS測量中所有三個角度的組合結果 (圖2，紅色) 一起繪制。使用背向散射檢測和小體積石英樣品池 (ZEN2112 Malvern Panalytical)，對每個樣品進行了5次重復測量。由于系統集成了ZS XPLORER軟件，儀器設置可以自動優化。

圖2 使用Zetasizer Ultra通過NIBS（藍色）和MADLS（紅色）測量的mRNA LNP制劑（LNP 1，A；LNP 2，B）的強度加權PSD。

對于LNP 1，使用DLS獲得的PSD顯示了樣品內的兩個粒子群 (圖2 A)。相比之下，與傳統NIBS相比，MADLS具有更高的PSD尺寸分辨率，可以識別出PSD中的三個不同峰。此外，對于LNP 2, DLS顯示了一個由寬峰代表的單一種群，而MADLS則識別了一個較大聚集體的小種群 (圖2 B)。已知這些較大的聚集體會使得背散射DLS數據變寬。

與此同時，多分散系數PDI值可以與平均粒徑結合使用來描述聚合體或團聚體的存在。查看PdI和%Pd可以揭示LNP1和LNP2在多分散性上的差異。在這種情況下，被認為是單分散體系的指標是%Pd小于20%，PdI為± 0.13。

表1通過DLS測定mRNA LNP制劑的多分散性

在本次測試中，我們可以看到LNP1是一個比LNP2更分散的樣本 (表1)。從MADLS數據中可以明顯看出PSD差異 （圖2；紅色），讓我們清楚地了解樣本中多個種群的存在，并顯示較大聚集體的峰值。

這是一個很好的例子，說明MADLS和DLS如何作為預篩選指標發揮重要作用，以確定樣本內聚集體的PSD。MADLS還允許我們測量~109和~1012個顆粒/mL之間的顆粒濃度-這擴展了其他技術的濃度范圍，如納米顆粒跟蹤分析(NTA[4])3 -并且可以在廣泛的濃度范圍內提供顆粒濃度的正交測量?？紤]到DLS和MADLS通常用于快速測定粒度、多分散性和/或濃度，該功能對于LNP的開發很重要，因為它可以幫助評估配方或處理步驟對樣品穩定性的影響。

03丨結果討論

評估物理特性，如粒徑分布和顆粒濃度，是有效開發LNP作為藥物遞送載體的關鍵。從這項研究中，我們可以看到DLS和MADLS等技術的價值，它們可以深入了解樣本的潛在不穩定性，例如，隨著時間的推移，聚集形成的情況 (參見表2，對可測量屬性和相關參數的概述)。

表2 DLS和MADLS測量的樣本屬性，以及相應的測量參數和所需的樣本信息

這兩種方法也經常用于了解從一個批次到另一個批次的一致性。DLS和MADLS都可以覆蓋很寬的粒徑范圍 (~1 nm到10 μm)，這使它們比其他技術具有優勢。一方面，DLS更適合于多分散性相對較低的樣品，其中可能存在另一種較大的顆粒。與此同時，MADLS使用多角度檢測來提供更高的PSD分辨率，從而提供有關樣本內潛在種群的更多信息。

雖然MADLS也可以作為一種篩選工具，用于檢測樣本中存在的較大聚集體的小種群 (見圖2B)，但它不能分辨大小差異小于2:1 (DLS為3:1)的小群體。然而，它可以用作其他顆粒濃度測量技術的正交驗證 (例如，納米顆粒跟蹤分析(NTA)，酶聯免疫吸附測定 (ELISA)等)。

參考文獻：

[1] Markova, N.; Cairns, S.; Jankevics-Jones, H.; Kaszuba, M.; Caputo, F.; Parot, J., Biophysical Characterization of Viral and Lipid-Based Vectors for Vaccines and Therapeutics with Light Scattering and Calorimetric Techniques. Vaccines (Basel) 2021, 10 (1).

[2] Tenchov, R.; Bird, R.; Curtze, A. E.; Zhou, Q., Lipid Nanoparticles─From Liposomes to mRNA Vaccine Delivery, a Landscape of Research Diversity and Advancement. ACS Nano 2021, 15 (11), 16982-17015.

[3] Austin, J.; Minelli, C.; Hamilton, D.; Wywijas, M.; Jones, H. J., Nanoparticle number concentration measurements by multi-angle dynamic light scattering. Journal of Nanoparticle Research 2020, 22 (5), 108.

[4] N. Markova, et al. Vaccines 10, 49 (2022).