【知識(shí)庫(kù)】DSC vs DSF技術(shù)大比拼，誰(shuí)更好

評(píng)估生物大分子的穩(wěn)定性至關(guān)重要，因?yàn)檫@直接關(guān)系到其在藥物開(kāi)發(fā)、疾病診斷、治療以及基礎(chǔ)生物學(xué)研究中的應(yīng)用前景和實(shí)際效能。穩(wěn)定性的評(píng)估能夠確保生物大分子在制備、存儲(chǔ)、運(yùn)輸及應(yīng)用過(guò)程中保持其結(jié)構(gòu)和功能，從而發(fā)揮預(yù)期的生物學(xué)活性，提高生物產(chǎn)品的療效和安全性。此外，穩(wěn)定性數(shù)據(jù)對(duì)于優(yōu)化生物大分子的生產(chǎn)和純化過(guò)程、延長(zhǎng)其貨架壽命、減少成本以及推動(dòng)科學(xué)研究的深入都有著重要作用。

在生物技術(shù)藥物開(kāi)發(fā)的“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)"(QbD) 方法中，穩(wěn)定性表征是所有候選藥物的“開(kāi)發(fā)可行性"和“成藥性"評(píng)估以及流程開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的一部分。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)還整合到用于生產(chǎn)支持、生物技術(shù)藥物可比性和生物相似性評(píng)估的高級(jí)結(jié)構(gòu) (HOS) 表征和“指紋圖譜"中。

由于生物大分子結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，生物物理工具在生物制藥產(chǎn)品的表征中非常重要。評(píng)估生物大分子穩(wěn)定性的生物物理工具多種多樣，其中差示掃描量熱法（DSC）與差示掃描熒光法（DSF）是表征生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的常用技術(shù)，本文主要聚焦兩種技術(shù)的異同點(diǎn)，旨在幫助大家選擇合適的技術(shù)評(píng)估各類生物大分子的穩(wěn)定性。

DSC 與 DSF，一字之差，大有不同

01丨測(cè)試原理

DSC：溶液中生物大分子以恒定加熱速率由自然（折疊）到變性（展開(kāi)），此過(guò)程涉及非共價(jià)鍵的斷裂為吸熱過(guò)程，DSC可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物分子隨溫度變化而發(fā)生的熱容（C_p）改變，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的處理（如積分）可以獲取如T_m值、T_onset、ΔH、ΔC_p等熱力學(xué)信息。

DSF：溶液中生物大分子以恒定加熱速率/不同變性劑條件下由自然（折疊）到變性（展開(kāi)），DSF可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)由于色氨酸從疏水到親水環(huán)境所導(dǎo)致的發(fā)射波長(zhǎng)改變/由于疏水區(qū)域暴露和環(huán)境敏感的疏水染料結(jié)合導(dǎo)致的熒光變化，進(jìn)而獲取T_m、T_onset等參數(shù)。

02丨適用樣品類型

DSC：由于DSC是監(jiān)測(cè)維系生物分子高級(jí)結(jié)構(gòu)非共價(jià)鍵斷裂的熱量吸收，所以對(duì)于蛋白、核酸、脂質(zhì)等各類分子都適用。

DSF：由于DSF是監(jiān)測(cè)色氨酸或疏水區(qū)暴露所引起的發(fā)射波長(zhǎng)或熒光信號(hào)的變化，所以測(cè)試樣品需有豐富的色氨酸/疏水區(qū)，DSF僅適用某些蛋白樣品，不適用于核酸、脂質(zhì)等樣品。若測(cè)試前蛋白已有部分變性（疏水區(qū)暴露）或樣品中含有去垢劑，則會(huì)造成較強(qiáng)的背景熒光。

03丨相關(guān)參數(shù)含義（T_m、ΔH_cal）

DSC：通過(guò)DSC測(cè)試所得到的T_m（熱轉(zhuǎn)變中點(diǎn)溫度）為體系中50%生物分子變性對(duì)應(yīng)的溫度，即峰值所對(duì)應(yīng)的溫度；ΔH_cal為每摩爾蛋白變性所吸收的熱量，一般用于衡量體系中生物分子的活性含量。

DSF：通過(guò)DSF測(cè)試得到的T_m值為體系中50%色氨酸/疏水區(qū)暴露時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度，色氨酸/疏水區(qū)的暴露無(wú)法真實(shí)的反應(yīng)蛋白變性過(guò)程，同時(shí)無(wú)法獲得ΔH等樣品活性信息。

04丨應(yīng)用

DSC：由于DSC具有良好的重復(fù)性，適合批間一致性分析和生物相似性打分分析；同時(shí)DSC具有結(jié)構(gòu)域級(jí)分辨率（可區(qū)分抗體CH2、CH3、Fab區(qū)域），適用于抗體等多個(gè)結(jié)構(gòu)域樣品的穩(wěn)定性評(píng)估。

DSF：DSF的重復(fù)性較差，難以進(jìn)行定量分析，但分析速度較快，適合穩(wěn)定性的快速初步篩選。

05丨DSC 應(yīng)用示例

DSC在核酸分析中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)的小分子藥物和抗體藥物相比，核酸藥物可針對(duì)不可成藥靶點(diǎn)、無(wú)需復(fù)雜蛋白生產(chǎn)工藝、具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便、研發(fā)周期短、靶向特異性強(qiáng)、治療領(lǐng)域廣泛和長(zhǎng)效性等優(yōu)點(diǎn)，目前在遺傳疾病、腫瘤、病毒感染等疾病的治療上應(yīng)用廣泛，有望成為繼小分子藥物和抗體藥物后的第三大類藥物。然而，由于核酸藥物本身攜帶負(fù)電、容易降解等問(wèn)題，導(dǎo)致其穩(wěn)定性差、半衰期短、遞送效率低，因此需要經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾或者是遞送系統(tǒng)達(dá)到長(zhǎng)期有效的治療效果。DSC可以非常靈敏的反應(yīng)出核酸化學(xué)修飾前后穩(wěn)定性的差異，然而其他穩(wěn)定性分析技術(shù)可能無(wú)法反應(yīng)出這些微小的變化。

DSC用于分析鎖核酸（LNA）摻入核酸的影響

鎖核酸（LNA）是一種經(jīng)過(guò)修飾的RNA，LNA中一部分核糖上的2‘與4’碳連結(jié)在一起，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，進(jìn)而增強(qiáng)磷酸鹽骨架的局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。該應(yīng)用利用DSC技術(shù)研究了LNA的摻入對(duì)DNA、RNA異源雙鏈體雜交熱力學(xué)的影響。LNA修飾后，峰圖明顯向右偏移；同時(shí)，隨著LNA修飾個(gè)數(shù)的增加，Tm值逐漸升高，表示雜交體的穩(wěn)定性因LNA的摻入變得更加穩(wěn)定。

DSC用于表征mRNA-LNP

通過(guò)PEAQ-DSC提供的LNP熱力學(xué)指紋圖譜，可以對(duì)比游離mRNA、mRNA-LNP以及LNP的穩(wěn)定性變化（圖2）。從圖中來(lái)看，mRNA組裝于LNP之后，T_m增大，表明mRNA-lipid產(chǎn)生相互作用之后，能穩(wěn)定彼此結(jié)構(gòu)，使得mRNA-LNP組裝更穩(wěn)定。

與DSF技術(shù)相比，DSC技術(shù)具有多方面優(yōu)勢(shì)，因此被認(rèn)為是生物制藥行業(yè)中熱穩(wěn)定性試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)：

• 無(wú)需標(biāo)記，適用樣品類型更豐富，且不受熒光背景及buffer成分干擾；

• 更寬的溫度范圍，適用具有較高T_m的樣品；

• 提供除T_m之外豐富的熱力學(xué)信息；

• 全局測(cè)定技術(shù)，具備高分辨率、高重復(fù)性，可分辨多結(jié)構(gòu)域樣品；

如果您分析的樣品為不含色氨酸的蛋白樣品或其它非蛋白樣品，或是要進(jìn)行精細(xì)的蛋白設(shè)計(jì)與改造、候選物篩選、配方優(yōu)化、可比性相似性評(píng)估等多種應(yīng)用，DSC都將是您的選擇！